Establecimiento e implementación de un protocolo simplificado de expansión y cultivo de Células Madre de Pulpa Dental Humana (DPSCh) / Estabelecimento e implementação de um protocolo simplificado para expansão e cultura de células-tronco da polpa dentária humana (DPSCh) / Establishing and implementing a simplified protocol for the expansion and culture of human dental pulp stem cells (hDPSCs)

Resumen Objetivos: Establecer e implementar un protocolo simplificado de extracción, aislamiento primario y cultivo de células madre derivadas de la pulpa dental humana (DPSCh). Analizar cuantitativamente y cualitativamente las células aisladas. Metodología: 10 terceros molares sanos donados por pacientes que concurrieron a la Facultad de Odontología, UdelaR y otorgaron su consentimiento escrito fueron procesados antes de las 48 hs. Se realizó la fractura de la pieza para la obtención del tejido pulpar y se procesó por el método explante. Se analizó viabilidad celular y expresión de marcadores por citometría de flujo en pasajes 4 y 12 y se corroboró mediante inmunocitoquímica. Resultados: Las células obtenidas presentaron una vitalidad mayor al 90% en todos los pasajes, observándose una morfología característica y expresión de marcadores de células madre mesenquimales CD90, C105, CD73, CD29 y 166 mediante citometría de flujo en ambos pasajes. Conclusiones: Se logró establecer un protocolo de aislamiento y expansión celular, con alta tasa de éxito de una población de DPSCh.

Resumo Objetivos: Estabelecer e implementar um protocolo simplificado para a extração, isolamento primário e cultura de células-tronco da polpa dentária humana (DPSCh). Analise as células isoladas quantitativa e qualitativamente. Metodologia: 10 terceiros molares saudáveis ​​doados por pacientes que frequentaram a Faculdade de Odontologia UdelaR e deram consentimento por escrito foram processados ​​antes de 48 horas. A fratura da peça foi realizada para obtenção do tecido pulpar e processada pelo método do explante. A viabilidade celular e a expressão do marcador foram analisadas por citometría de fluxo nas passagens 4 e 12 e confirmadas por inmunocitoquímica. Resultados: As células obtidas apresentaram viabilidade superior a 90% em todas as passagens, observando uma morfologia característica e expressão dos marcadores de células-tronco mesenquimais CD90, C105, CD73, CD29 e 166 por citometría de fluxo em ambas as passagens. Conclusões: Foi possível estabelecer um protocolo de isolamento celular, com alta taxa de sucesso e segurança para isolar o DPSCh.

Abstract Objectives: To establish and implement a simplified protocol for the extraction, primary isolation, and culture of human dental pulp stem cells (hDPSCs). To analyze the isolated cells quantitatively and qualitatively. Methodology: Ten healthy third molars were donated by patients who attended the School of Dentistry, UdelaR, and gave their written consent. The teeth were processed within 48 hours. The teeth were sectioned to obtain the pulp tissue and processed with the explant method. Cell viability and marker expression were analyzed by flow cytometry at passages 4 and 12 and verified by immunocytochemistry. Results: The cells obtained had a vitality greater than 90% in all passages. We found the characteristic morphology and the expression of CD90, C105, CD73, CD29 and 166 mesenchymal stem cell markers by flow cytometry in both passages. Conclusion: It was possible to establish a cell isolation protocol that is highly successful and safe to isolate hDPSC.

A complexidade cicatricial em queimaduras e a possibilidade da terapia com células-tronco derivadas do tecido adiposo: revisão / The complexity of burn healing and the possibility of adipose tissue-derived stem cell therapy: review / La complejidad de la cicatrización de las quemaduras y la posibilidad de la terapia con células madre derivadas del tejido adiposo: revisión

OBJETIVO: Verificar as especificidades do processo cicatricial em queimaduras e identificar se as células-tronco derivadas do tecido adiposo (CTDA) podem se tornar aliadas em sua reparação. MÉTODO: Realizou-se uma revisão da literatura com consultas a Biblioteca Virtual de Saúde, Google Acadêmico, PubMed, Scientific Electronic Library Online, Mendeley catalog of academic literature, artigos e bibliografia especilizada em cicatrização, queimaduras, células-tronco derivadas do tecido adiposo publicados entre 2012 e 2016. RESULTADOS: As queimaduras se diferenciam de outras lesões pela intensidade da inflamação sistêmica e pela sobreposição das fases cicatriciais desorganizando-as. As CTDA são encontradas no estroma vascular do tecido adiposo e podem ser obtidas por lipoaspiração. Estas células podem interferir nas fases cicatriciais pela secreção de citocinas de crescimento, substâncias imunomoduladoras e anti-inflamatórias, assim como pela capacidade de diferenciação celular e homing. CONCLUSÃO: As queimaduras ocorrem na população mundial de forma preocupante, com características de morbidade e mortalidade. Os problemas sistêmicos e locais da reparação tecidual parecem ser atenuados pelas CTDA, sua abundante disponibilidade para o cultivo celular e suas habilidades as apontam como aliadas na recuperação das queimaduras.(AU)

OBJECTIVE: To evaluate the distinctions of the healing process in burns and identify how the adipose-tissue derived stem cells (ATSC) may become allies in this repair process. METHODS: Review of the literature was carried out with consultations at Virtual Health Library, Google Scholar, PubMed, Scientific Electronic Library Online and Mendeley catalog of academic literature and specialized bibliography in healing, burns and ATSC published between 2012 and 2016. RESULTS: Burns differentiate themselves from other lesions by the intensity of systemic inflammation and by the overlapping of the healing wound phases disorganizing them. The ATSC are found in the vascular stroma of adipose tissue and can be obtained by liposuction. These cells can interfere in the healing wound phases by the secretion of growth cytokines, immunomodulatory and anti-inflammatory substances and the ability of cell differentiation and homing. CONCLUSION: Burns occur in the world population in a worrisome way with characteristics of morbimortality. The problems of tissue repair seem to be attenuated by ATSC, their abundant availability for cell culture and their abilities point them as promising allies in healing of burn wound.(AU)

Objetivo: Verificar las especificidades del proceso cicatricial en quemaduras y identificar si las células-tronco derivadas del tejido adiposo (CTDA) pueden tornarse aliadas en su reparación. Método: Se realizó una revisión del literatura con consultas en Biblioteca Virtual de Salud, Google Académico, PubMed, Scientific Electronic Library online online, Mendeley catalog of academic literature, artículos y bibliografía especilizada, quemaduras, CTDA, publicados entre 2012 y 2016. Resultados: Las quemaduras se diferencian de otras lesiones por la intesidad de la inflamación sistémica y por la sobreposición de las fases cicatriciales desorganizándolas. Las CTDA son encontradas en el estroma vascular del tejido adiposo y pueden ser obtenidas por lipoaspiracion. Estas celulas pueden interferir en las fases cicatriciales por secrecion de citoquinas del crecimiento, sustancias inmunomoduladoras, anti inflamatorias y por la capacidad de diferenciacion celular e homing. Conclusión: Las quemaduras ocurren en la población mundial de forma preocupante con caracteristicas de morbimortalidad. Los problemas de la reparacion tecidual parecen ser atenuados por las CTDA, su abundante disponibilidad para el cultivo celular y sus habilidades las apuntan como aliadas en la recuperacion de las quemaduras.(AU)

Common calcaneal tendon repair with glycerin-preserved carotid artery xenografts and autologous bone marrow mononuclear cells in rabbits / Reparo de tendão calcanear comum de coelhos com xenoimplante de artéria carótida preservada em glicerina associado a células mononucleares da medula óssea autólogas

Fifteen adult rabbits were used to evaluate the repair of experimental common calcaneal tendon defects treated with glycerin-preserved canine carotid artery xenografts alone or associated with autologous mononuclear bone marrow cells (AMCs). Rabbits were submitted to daily clinical examination; implanted sites were analyzed under light microscopy within 15, 30 and 60 days of surgery. Pelvic limbs receiving xenografts associated with AMCs had better physical performance as well as higher collagen fiber, fibroblast, lymphocyte and new vessel counts at all postoperative time points considered. Glycerin-preserved canine carotid artery xenografts associated with AMCs constituted an effective method for common calcaneal tendon repair in rabbits.(AU)

Utilizou-se 15 coelhos adultos para avaliar o reparo de lesão do tendão calcanear comum com implante de artéria carótida de cães, preservada em glicerina, associado ou não a células mononucleares autólogas da medula óssea (CMAs). Os animais foram observados diariamente por meio de avaliações clínicas e o local do implante foi analisado sob microscopia de luz decorridos 15, 30 e 60 dias de pós-operatório. Notou-se em todos os períodos de observação, com o implante associado às CMAs, melhor desempenho físico dos membros pélvico e maior intensidade de fibras colágenas, fibroblastos e linfócitos e neovascularização. A utilização de xenoimplante de artéria carótida de cães preservada em glicerina associado à administração de células mononucleares da medula óssea foi eficiente no reparo do tendão calcanear comum de coelhos.(AU)

Fração vascular estromal, uma nova terapêutica no fotovelhecimento: estudo comparativo e controlado / Stromal vascular fraction, a new therapy in photoaging: a comparative controlled study

Introdução: A fração vascular estromal derivada do tecido adiposo é fonte rica de diferentes células, contendo grande população de células-tronco, que tem capacidade de diferenciação para diversas linhagens. Em dermatologia, há diversos estudos sobre a eficácia das células-tronco, que apresentam ação antioxidante e efeitos no rejuvenescimento. No entanto, ainda são poucos os relatos sobre os efeitos antienvelhecimento da fração vascular estromal. Objetivo: Avaliar a efetividade da fração vascular estromal no rejuvenescimento facial. Métodos: Estudo prospectivo, comparativo e controlado, com 10 pacientes divididos em dois grupos e submetidos a tratamento do sulco nasogeniano com: Grupo 1: fração vascular estromal e Grupo 2: preenchedor convencional: hidroxiapatita de cálcio. Foram realizadas avaliações clínica, fotográfica e histológica com análise estatística dos dados. Resultado: Ambas as técnicas produziram resultados satisfatórios e semelhantes. Conclusões: A aplicação da fração vascular estromal é técnica relativamente nova que apresenta bons resultados clínicos, sendo opção promissora para o rejuvenescimento.

Introduction: Stromal vascular fraction derived from adipose tissue is a rich source of different cells, containing large amounts of stem cells, which ability for diferentiation into various strains. In dermatology, there are several studies on the effectiveness of stem cells, which present antioxidant and rejuvenating effects. However, there are few reports about the anti-aging effects of stromal vascular fraction. Objective: To evaluate the effectiveness of stromal vascular fraction in facial rejuvenation. Methods: A prospective, comparative, controlled study was carried out, wit, with 10 patients divided into two groups and subjected to treatment of nasolabial folds with: Group 1: stromal vascular fraction and Group 2: conventional filler (calcium hydroxyapatite). Clinical, photographic and histological evaluations were conducted, with statistical analysis of data. Results: Both techniques produced satisfactory results and were similar. Conclusion: Application of stromal vascular fraction is a relatively new technique that presents good clinical results and is a promising option for rejuvenation.

Fração total de células mononucleares intra-articular em cães submetidos à reconstrução do ligamento cruzado / Total fraction of mononuclear intra-articular cells in dogs undergoing cruciate ligament reconstruction

Avaliou-sea ação da fração total de células mononucleares autógenas da medula óssea (FCMO) por aplicação intra-articular, após a correção cirúrgica do ligamento cruzado rompido. Foram utilizados 20 cães, os quais sofreram desmotomia do ligamento cruzado cranial e caudal unilaterais, 21 dias antes do reparo cirúrgico. Dez animais receberam as células autógenas no momento da correção. As avaliações se deram por estudo radiográfico, exames clínicos e biópsias aos 50 e 90 dias pós-operatórios. O grupo que recebeu a FCMO apresentou crescimento ósseo intra-articular ao estudo radiográfico, contudo os 20 animais apresentaram célulasCD34 positivas em suas amostras biopsiadas, indicando haver presença de células-tronco em ambos os grupos. Conclui-se que,para o modelo experimental proposto, não se recomenda o uso da fração total de células mononucleares e que trabalhos experimentais com o uso de células-tronco nas articulações devem evitar modelos cujo foco de lesão mantenha contato direto com a medula óssea.

This study was performed to evaluate the action of the fraction of total mononuclear cells from the bone marrow (FCMO) applied intra-articularly after the surgical repair of an experimentally ruptured cruciate ligament. Twenty dogs which suffered one-sided cruciate desmotomy of the cranial and caudal cruciate ligament 21 days before the correction were used. Ten animals received the FCMO at the time of correction. The assessments were done through X-ray and clinical examinations, and biopsies at 50 and 90 days postoperatively. It was concluded that there was no clinical difference between the two groups until 90 days of evaluation. The group that received FCMO grew intra-articular bone shown on the X-ray study. All twenty animals, however, presented cells marked with CD34 antibodies on their biopsy samples, indicating the presence of stem cells in both groups. It is concluded thatfor theexperimental model, it is not recommended to use the mononuclear cell fraction,andin experimental studies with the use of stem cells in the joints models whose focus of injury keep direct contact with the bone marrow should be avoided.

Characterization of human adipose-derived stem cells / Caracterização de células-tronco do tecido adiposo humano

PURPOSE: There is a growing scientific interest in the plasticity and therapeutic potential of adipose-derived stem cells (ASCs), which are multipotent and abundant in adipose tissue and can differentiate in vitro into multiple lineages, including adipocytes, chondrocytes, osteoblasts, neural cells, endothelial cells and cardiomyocytes. The aim of this study was to isolate, cultivate and identify ASCs. METHODS: Human adipose precursor cells were obtained from subcutaneous abdominal tissue. Recently dispersed cells were separated by density centrifugation gradient, cultured and then analyzed. RESULTS: Human ASCs were able to replicate in our culture conditions. The cells maintained their phenotypes throughout the studied period on different passages confirming they suitability for in vitro cultivation. We also induced their adipogenic, osteogenic and chondrogenic differentiation, verifying their mesenchymal stem cells potentiality in vitro. Flow cytometry results showed that these cells expressed CD73, CD90 and CD105, (mesenchymal stem-cells markers), contrasting with the lack of expression of CD16, CD34 and CD45 (hematopoietic cells markers). CONCLUSION: It was possible to isolate human adipose-derived stem cells by in vitro cultivation without adipogenic induction, maintaining their functional integrity and high proliferation levels. The cells demonstrated adipogenic, osteogenic and chondrogenic differentiation potential in vitro.

OBJETIVO: Há um interesse científico crescente na plasticidade e potencial terapêutico das células-tronco do tecido adiposo humano, células multipotentes e abundantes no tecido adiposo que podem se diferenciar in vitro em múltiplas linhagens celulares, incluindo adipócitos, condrócitos, osteoblastos, células neurais, endoteliais e cardiomiócitos. O objetivo deste estudo foi isolar, cultivar e identificar células-tronco do tecido adiposo humano. MÉTODOS: Células precursoras humanas do tecido adiposo foram obtidas de tecido abdominal subcutâneo. As células recém-dispersas foram separadas por gradiente de centrifugação por densidade, cultivadas e então analisadas. RESULTADOS: As células-tronco do tecido adiposo humano foram capazes de se replicar nas nossas condições de cultivo e mantiveram seu fenótipo em diferentes passagens durante o estudo, confirmando sua adequabilidade para cultivo in vitro. A diferenciação adipogênica, osteogênica e condrogênica também foi induzida, confirmando seu potencial de células-tronco mesenquimais in vitro. Os resultados de citometria de fluxo evidenciaram a expressão dos marcadores de células-tronco mesenquimais CD73, CD90 e CD105, contrastando com a falta de expressão dos marcadores de células hematopoiéticas CD16, CD34 e CD45. CONCLUSÃO: Foi possível isolar células-tronco do tecido adiposo humano por cultivo in vitro sem indução adipogênica, mantendo sua integridade funcional e altos níveis de proliferação. As células demonstraram potencial de diferenciação adipogênico, osteogênico e condrogênico in vitro.

Potencial de transdiferenciação neural das células-tronco mesenquimais da medula óssea de equino / Potential of neural transdifferentiation of mesenchymal stem cells from equine bone marrow

Os primeiros estudos demonstrando o potencial de trandiferenciação neural das células-tronco mesenquimais (CTMs) provenientes da medula óssea (MO) foram conduzidos em camundogos e humanos no início da década de 2000. Após esse período, o número de pesquisas e publicações com o mesmo propósito tem aumentado, mas com raros ou escassos estudos na espécie equina. Nesse sentindo, o objetivo desse trabalho foi avaliar o potencial in vitro da transdiferenciação neural das CTMs provenientes da MO de equinos utilizando-se dois protocolos: P1 (forksolin e ácido retinóico) e P2 (2-βmecarptoetanol). Após a confirmação das linhagens mesenquimais, pela positividade para o marcador CD90 (X=97,94%), negatividade para o marcador CD34 e resposta positiva a diferenciação osteogênica, as CTMs foram submetidas a transdiferenciação neural (P1 e P2) para avaliação morfológica e expressão dos marcadores neurais GFAP e β3 tubulina por citometria de fluxo. Os resultados revelaram mudanças morfológicas em graus variados entre os protocolos testados. No protocolo 1, vinte quatro horas após a incubação com o meio de diferenciação neural, grande proporção de células (>80%) apresentaram morfologia semelhante a células neurais, caracterizadas por retração do corpo celular e grande número de projeções protoplasmáticas (filopodia). Por outro lado, de forma comparativa, já nos primeiros 30 minutos após a exposição ao antioxidante β-mercaptoetanol (P2) as CTMs apresentaram rápida mudança morfológica caracterizada principalmente por retração do corpo celular e menor número de projeções protoplasmáticas. Também ficou evidenciado com o uso deste protocolo, menor aderência das células após tempo de exposição ao meio de diferenciação, quando comparado ao P1. Com relação a análise imunofenotípica foi observado uma maior (P<0,001) expressão dos marcadores GFAP e β3 tubulina ao término do P2 quando comparado ao P1. A habilidade das CTMs em gerar tipos celulares relacionados a linhagem neural é complexa e multifatorial, dependendo não só dos agentes indutores, mas também do ambiente no qual estas células são cultivadas. Desta forma um maior número de estudos é necessário para o melhor entendimento do processo de transdiferenciação neural a partir de CTMs de equinos.

The first studies showing the potential of neural transdifferentiation of mesenchymal stem cells (MSCs) from bone marrow (BM) were conducted in camundogos and humans in the early 2000s. After this period, the number of research and publications with the same purpose increased, but with rare or scarce studies in horses. The aim of this study was to evaluate in vitro neuronal transdifferentiation potential of MSCs from equine BM using two protocols: P1 (forksolin and retinoic acid) and P2 (2-βmecarptoetanol). After confirming the mesenchymal lineages, by positivity for the marker CD90 (X=97.94%), negative for the marker CD34 and positive response for osteogenic differentiation, MSCs were subjected to neural transdifferentiation (P1 and P2) for morphological analysis and expression of neural markers GFAP and β3 tubulin by flow cytometry. The results revealed morphological changes in varying degrees between the tested protocols. In protocol 1, twenty four hours after incubation with the media of neural differentiation, a large proportion of cells (>80%) had similar morphology to neural cells, characterized by retraction of cellular body and a large number of cytoplasmic extension (filopodia). However, comparatively, within the first 30 minutes after exposure to the antioxidant β-mercaptoethanol (P2) MSCs showed rapid morphological changes characterized mainly by retraction of cellular body and less cytoplasmic extension. It was also evidenced with the use of this protocol, lower cellular adhesion after exposure to media when compared to P1. Regarding the immunophenotyping analysis it was observed a higher (P<0.001) expression of the markers GFAP and β3 tubulin at the end of P2 compared to P1. The ability of MSCs to generate cell types related to neural lineage is complex and multifactorial, depending not only of inducing agents, but also the environment in which these cells will be cultivated. Thus a greater number of studies are necessary to better understand the process of neural transdifferentiation of MSCs from equine.

Engraftment of human adipose derived stem cells delivered in a hyaluronic acid preparation in mice / Implante de células tronco do tecido adiposo humano numa preparação de ácido hialurônico em camundongos

PURPOSE: To evaluate the implant of human adipose derived stem cells (ADSC) delivered in hyaluronic acid gel (HA), injected in the subcutaneous of athymic mice. METHODS: Control implants -HA plus culture media was injected in the subcutaneous of the left sub scapular area of 12 athymic mice. ADSC implants: HA plus ADSC suspended in culture media was injected in the subcutaneous, at the contra lateral area, of the same animals. With eight weeks, animals were sacrificed and the recovered implants were processed for extraction of genomic DNA, and histological study by hematoxilin-eosin staining and immunufluorescence using anti human vimentin and anti von Willebrand factor antibodies. RESULTS: Controls: Not visualized at the injection site. An amorphous substance was observed in hematoxilin-eosin stained sections. Human vimentin and anti von Willebrand factor were not detected. No human DNA was detected. ADSC implants - A plug was visible at the site of injection. Fusiform cells were observed in sections stained by hematoxilin- eosin and both human vimentin and anti von Willebrand factor were detected by immunofluorescence. The presence of human DNA was confirmed. CONCLUSION: The delivery of human adipose derived stem cells in preparations of hyaluronic acid assured cells engraftment at the site of injection.

OBJETIVO: Avaliar o implante de células tronco do tecido adiposo humano (CTTAH) em gel de ácido hialurônico (AH), injetados no tecido subcutâneo de camundongos atímicos. MÉTODOS: Implantes controle - HA com meio de cultura foram injetados no tecido subcutâneo da região infraescapular esquerda de 12 camundongos atímicos. Implantes de CTTAH: HA com CTTAH suspensas em meio de cultura foi injetado no subcutâneo da região contra lateral, dos mesmos animais. Com oito semanas, os animais foram sacrificados e os implantes recuperados foram processados para extração de DNA genômico, estudo histológico por coloração por hematoxilina eosina e imnuoflurescência utilizando anticorpos anti vimentina humana e anti fator de von Willebrand. RESULTADOS: Controles - implantes não visualizados no local da injeção. Uma substância amorfa foi observada nos cortes corados por hematoxilina eosina. Vimentina humana e fator anti von Willebrand não foram identificados. DNA humano não foi detectado. Implantes de CTTAH - Uma massa era visível no local da injeção. Células fusiformes foram observadas nos corte corados com hematoxilina eosina. Tanto vimentina humana quanto fator de von Willebrand foram identificados pela imunofluorescência. A presença de DNA humano foi confirmada. CONCLUSÃO: O implante de células tronco do tecido adiposo humano em veículo de ácido hialurônico gel assegurou a manutenção das células no local do implante.

O intervalo de tempo entre coleta e processamento do sangue de cordão umbilical influencia na qualidade da amostra? / Does the time between collecting and processing umbilical cord bloodsamples affect the quality of the sample?

Objective: To assess the association between the time from umbilical cord blood collection until processing and the quality of the sample. Methods: Umbilical cord blood samples collected during the third stage of labor were placed in temperature-controlled boxes for the transport of biological material and sent to an umbilical cord blood bank, where the number of nucleated cells, viable cells and CD34+ cells were counted, and samples were additionally tested for contamination at the following time intervals: up to 24 hours, up to 48 hours and up to 72 hours following sampling. Data were analyzed using the multivariate analysis of variance (MANOVA) and compared using McNemar's X2 test. Significance was defined at p < 0.05. Results: Means and medians of the number of nucleated cells, viable cells and CD34+ cells decreased significantly (p < 0.0001) as a function of the increased time between sampling and analysis, the difference between 24 and 48 hours being less than the difference between 24 and 72 hours. A linear correlation was found between the mean number of viable cells and CD34+ cells at the three moments of analysis. Contamination testing was negative in all samples. Conclusion: The increase in time interval from sampling until analysis negatively affected the number of nucleated cells, viable cells and CD34+ cells but was not associated with specimen contamination. A linear correlation was found between decrease in the number of viable cells and CD34+ cells.

Objetivo: Avaliar a associação do intervalo de tempo entre coleta e processamento do sangue de cordão umbilical e a qualidade da amostra. Métodos: As amostras de sangue de cordão umbilical, colhidas no terceiro período do parto, foram acondicionadas em caixas homologadas para transporte de material biológico, com monitoração da temperatura, e enviadas a um banco de sangue de cordão umbilical, onde foram submetidas à contagem do número de células nucleadas, do número de células viáveis, do número de células CD 34+ e pesquisa de contaminação, nos intervalos de tempo de até 24, até 48 e até 72 horas. Os dados foram analisados pelo teste de variância para medidas repetidas MANOVA e comparados por meio do teste do X2 de Mc Nemar, considerando-se nível de significância de 5%. Resultados: As médias e as medianas do número de células nucleadas, número de células viáveis e número de células CD34+ tiveram quedas significativas (p < 0,0001) com o aumento do intervalo de tempo de coleta/processamento, sendo entre 24 e 48 horas menor do que a comparação entre 24 e 72 horas. Constatada correlação linear entre as médias de células viáveis e células CD34+ nos três momentos da análise. A pesquisa de contaminação foi negativa em todas as amostras. Conclusão: O aumento do intervalo de tempo de coleta/processamento influenciou negativamente na contagem de células nucleadas, células viáveis e CD34+ e não esteve associado à contaminação das amostras. Foi constatada correlação linear entre a queda do número de células viáveis e de células CD34+.

Células-tronco derivadas de tecido adiposo: isolamento, cultivo in vitro e perspectivas de utilização em dermatologia / Adipose tissue derived stem cells: isolation, in vitro culture and potential uses in dermatology

É extensa a literatura existente sobre as características e potenciais terapêuticos das células-tronco mesenquimais adultas, e a possibilidade de seu isolamento a partir de tecido adiposo excedente de outros procedimentos é promissora e extremamente desejável. Os protocolos para tal utilização, porém, ainda são descritos de maneira sumarizada e não padronizada. O objetivo dessa comunicação é apresentar um protocolo simples, prático e eficaz tanto da coleta do tecido adiposo em ambiente hospitalar quanto do isolamento e cultivo, em laboratório, in vitro de células-tronco mesenquimais adultas derivadas de tecido adiposo, com a finalidade de discutir as perspectivas da utilização dessa técnica na dermatologia.

Uso de células-tronco cultivadas ex vivo na reconstrução da superfície ocular / Use of stem cells cultured ex vivo for ocular surface reconstruction

Lesões na superfície ocular podem atingir as células-tronco do limbo e causar deficiência límbica. A deficiência límbica é caracterizada pela conjuntivalização, que pode ser definida como a invasão do epitélio conjuntival sobre a córnea. Este processo é acompanhado por graus variáveis de alterações corneanas, como neovascularização, inflamação, erosões recorrentes, defeitos epiteliais persistentes, destruição da membrana basal do epitélio e cicatrização estromal. Frequentemente, estas alterações estão associadas à diminuição da acuidade visual, fotofobia e desconforto ocular. O melhor tratamento para essa afecção não é conhecido e possibilidades variam em casos uni ou bilaterais. Entre os tratamentos disponíveis, o transplante de limbo autólogo ou alógeno é um dos mais utilizados. Para melhorar os resultados dos transplantes alógenos, alguns pesquisadores utilizam o transplante de epitélio da córnea cultivado em laboratório pela expansão ex vivo de células-tronco epiteliais límbicas. Mas devido à limitada disponibilidade de tecido autólogo do limbo e o risco de complicações associadas à imunossupressão em transplante de tecido alógeno, pesquisas de outras opções de células-tronco cultivadas ex vivo têm sido descritas em fase experimental e clínica. Essa revisão descreve os novos tipos de células-tronco cultivadas ex vivo, seus resultados atuais e potencialidades futuras.

Lesions on the ocular surface can destroy the stem cells from the limbus and cause limbal stem cell deficiency. The limbal stem cell deficiency is marked by conjunctivalization, which can be defined as the invasion of conjunctival epithelium over the cornea. This process is accompanied by varying degrees of corneal changes such as neovascularization, inflammation, recurrent erosions, persistent epithelial defects, destruction of basement membrane of epithelium and stromal healing. Often, these changes are associated with poor visual acuity, photophobia and ocular discomfort. The best treatment for this disease is not known and varies in unilateral or bilateral cases. Among the treatments available, transplantation of limbal autograft or allograft is one of the most used. To improve the outcome of allotransplantation, some researchers use the transplantation of corneal epithelium cultured in the laboratory by ex vivo expansion of limbal stem cells, but due to limited availability of autologous tissue from the limbus and the risk of complications associated with immunosuppression in allogeneic tissue transplantation, researches of others options of stem cell cultured ex vivo have been described in experimental and clinical stage. This review describes the new types of stem cells cultured ex vivo, their current results and future potential.

Células-tronco derivadas de tecido adiposo humano: desafios atuais e perspectivas clínicas / Human adipose-derived stem cells: current challenges and clinical perspectives

As células-tronco adultas ou somáticas detêm grande promessa para a reparação e regeneração de tecidos. Atualmente, o interesse dos cientistas é contínuo na investigação da biologia de células-tronco mesenquimais, tanto em aspectos básicos, quanto no potencial de aplicações terapêuticas. As células-tronco adultas derivadas do estroma do tecido adiposo, em comparação com as células-tronco derivadas do estroma da medula óssea, apresentam como vantagem o método fácil de obtenção da fonte tecidual. As células-tronco adultas derivadas do estroma do tecido adiposo apresentam potencial para se diferenciarem em células de tecidos mesodérmicos, como os adipócitos, as cartilagens, os ossos e o músculo esquelético e não mesodérmicos, como os hepatócitos, as células pancreáticas endócrinas, os neurônios, os hepatócitos e as células endoteliais vasculares. Entretanto, os dados disponíveis na literatura científica sobre as características das células-tronco adultas derivadas do estroma do tecido adiposo e os procedimentos para sua obtenção e manipulação no laboratório são inconsistentes. É necessário o desenvolvimento de metodologias e procedimentos eficazes de isolamento dessas células para obtenção de células em quantidade e qualidade suficientes para aplicação terapêutica. Nesta revisão, são discutidos os métodos correntes de coleta de tecido adiposo, isolamento e caracterização de células-tronco adultas derivadas do estroma do tecido adiposo, com ênfase na futura aplicação em medicina regenerativa e nos possíveis desafios nesse recente campo da ciência.

Adult or somatic stem cells hold great promise for tissue regeneration. Currently, one major scientific interest is focused on the basic biology and clinical application of mesenchymal stem cells. Adipose tissue-derived stem cells share similar characteristics with bone marrow mesenchymal stem cells, but have some advantages including harvesting through a less invasive surgical procedure. Moreover, adipose tissue-derived stem cells have the potential to differentiate into cells of mesodermal origin, such as adipocytes, cartilage, bone, and skeletal muscle, as well as cells of non-mesodermal lineage, such as hepatocytes, pancreatic endocrine cells, neurons, cardiomyocytes, and vascular endothelial cells. There are, however, inconsistencies in the scientific literature regarding methods for harvesting adipose tissue and for isolating, characterizing and handling adipose tissue-derived stem cells. Future clinical applications of adipose tissue-derived stem cells rely on more defined and widespread methods for obtaining cells of clinical grade quality. In this review, current methods in adipose tissue-derived stem cell research are discussed with emphasis on strategies designed for future applications in regenerative medicine and possible challenges along the way.

Proposals for embryonic stem cell production without destroying human embryos: scientific and bioethical challenges / Propuestas de producción de células madre embrionarias sin destruir embriones humanos: retos científicos y bioéticos / Propostas de produção de células-tronco embrionárias sem destruir embriões humanos: desafios científicos e bioéticos

The possibility of using human embryonic stem cells (ESC) for therapeutic purposes raises serious ethical objections, the most fundamental one being that until recently the only way to obtain ESC was with procedures that necessarily destroyed living human embryos. Due to this, research in this field has been rejected by many scientists, bioeticists, and has been banned by law in several countries. Efforts have been made to find procedures to obtain ESC without destroying embyros or putting them at risk. This paper reviews the scientific, technical and ethical aspects of the different strategies developed for this purpose. Embryo biopsy, ESC obtained from "dead" embryos, ESC produced by "parthenogenetic embryos", ESC obtained by Altered Nuclear Transfer and induced pluripotent cells (iPSC) obtained by direct epigenetic reprogramming of somatic cells are the main five alternative reported in recent studies.

La posibilidad de usar células madre embrionarias humanas (ESC) para finalidades terapéuticas plantea graves objeciones éticas; la más fundamental es que, hasta hace poco, la única manera de obtener ESC era mediante procedimientos que destruían necesariamente embriones humanos vivos. Debido a esto, la investigación en este campo ha sido rechazada por muchos científicos, bioeticistas y ha sido prohibida por ley en varios países. Se han realizado esfuerzos para encontrar procedimientos que permitan obtener ESC sin destruir embriones o sin ponerlos en riesgo. En este documento examinamos los aspectos científicos, técnicos y éticos de las diferentes estrategias elaboradas para esta finalidad. La biopsia de embriones, ESC obtenidas de embriones "muertos"; ESC producidas por partenogénesis de embriones; ESC obtenidas mediante Transferencia Nuclear Alterada y células pluripotentes inducidas (iPSC), obtenidas mediante la reprogramación epigenética directa de las células somáticas, son las principales cinco opciones informadas en estudios recientes.

A possibilidade de se utilizar células-tronco embrionárias humanas (ESC) para finalidades terapêuticas apresenta graves objeções éticas, a mais fundamental é que, até recentemente, era a única maneira de obter ESC mediante procedimentos que destruíam necessariamente embriões humanos vivos. Devido a isso, a investigação neste campo tem sido recusada por muitos pesquisadores, bioeticistas e proibida por lei em vários paises. Esforços são realizados para encontrar procedimentos que permitam obter ESC sem destruir embriões ou colocá-los em risco. Neste documento examinamos os aspectos científicos, técnicos e éticos das diferentes estratégias elaboradas para esta finalidade. Biópsia de embriões, ESC obtidas de embriões "mortos"; ESC produzidas por partenogênese de embriões; ESC obtidas mediante Transferência Nuclear Alterada e células pluripotentes induzidas (iPSC), obtidas mediante a reprogramação epigenética direta das células somáticas, são as cinco principais opções informadas em estudos recentes.

Comparative study of technique to obtain stem cells from bone marrow collection between the iliac crest and the femoral epiphysis in rabbits / Estudo comparativo da técnica para a obtenção de células tronco pela coleta de medula óssea entre a crista ilíaca e epífise do fêmur em coelhos

PURPOSE: To assess the technique for the collection of rabbit bone marrow stem cells from different regions to be used as an experimental model in regenerative medicine. METHODS: Thirty rabbits were allocated into 2 groups: GROUP A, n=8, animals that underwent bone marrow blood (BMB) harvesting from the iliac crest; and GROUP B: including 22 rabbits that underwent BMB harvesting from the femur epiphysis. After harvesting, mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation (Ficoll - Histopaque). The number of mononuclear cells per ml was counted in a Neubauer chamber and cell viability was checked through Tripan Blue method. RESULTS: Harvesting from the iliac crest yielded an average of 1 ml of BMB and 3,6.10(6) cells/ml over 1 hour of surgery, whereas an average of 3ml of BMB and 11,79.10(6) cells./ml were obtained in 30 min from the femur epiphysis with a reduced animal death rate. CONCLUSION: The analysis for the obtention of a larger number of mononuclear cells/ml from rabbit bone marrow blood was more satisfactory in the femur epiphysis than in the iliac crest.

OBJETIVO: Avaliar a técnica mais promissora para a coleta de células tronco adultas de medula óssea de coelhos para a utilização do mesmo como modelo experimental na medicina regenerativa. MÉTODOS: Foram utilizados 30 coelhos divididos em 2 grupos: GRUPO A, n=8, onde realizamos a coleta de sangue de medula óssea (MO) da crista ilíaca e grupo B, n=22, onde realizamos a coleta de sangue da medula óssea da epífise do fêmur. Após as coletas, realizamos a separação das células mononucleadas através do gradiente de densidade (Ficoll-Hystopaque). Através da câmara de Neubauer realizamos a contagem das células mononucleadas por ml. Testamos a viabilidade celular através do método Tripan Blue. RESULTADOS: Na coleta de sangue de MO na crista ilíaca obtivemos a média de 1 ml durante 1 hora de procedimento cirúrgico, obtendo a quantidade de 3,6 .10(6) células/ml, enquanto que a punção na epífise do fêmur obtivemos a média de 3 ml durante 30 minutos de procedimento cirúrgico obtendo a quantidade de 11,79.10(6) cél./ml diminuindo o óbito dos animais. CONCLUSÃO: A análise para a obtenção de maior número de células mononucleadas/ml de sangue de medula óssea de coelho foi mais satisfatória na região da epífise do fêmur em comparação com a crista ilíaca.

Células-tronco de medula óssea em isquemia crítica de membros / Bone marrow stem cells in critical limb ischemia

Os autores discutem aspectos clínicos e de tratamento convencional da isquemia critica dos membros inferiores e consideram a possibilidade de tratamento com células-tronco autógenas de medula óssea para os pacientes que já esgotaram, sem sucesso, todos os meios de tratamento conhecidos. Comentam sobre o histórico, as fontes, as experiências animais e clínicas e, finalmente, apresentam sua experiência inicial com seis pacientes, todos com indicação de amputação maior ou menor. Em apenas um paciente não foi possível evitar a amputação. Além de ótimos resultados, quanto à supressão da dor e cicatrização de lesões isquêmicas, pode-se notar a ausência de quaisquer efeitos colaterais deletérios, sugerindo que a terapia celular é eficiente e segura, demandando, porém, mais pesquisas e estudos randomizados para se tornar uma terapia de uso corrente.

The authors discuss clinical aspects and conventional treatment of lower limb critical ischemia and the alternative of therapy with autogenous bone marrow stem cells in patients who have exhausted, without success, all the current means of treatment. They comment on the historical aspects, the sources, animal experiments, clinical research and, finally, their initial experience with six patients, all of whom had previous indication of major or minor amputation. For only one patient amputation could not be avoided. In addition to excellent results in pain relief and healing of ischemic ulcers, no deleterious side effects were noted suggesting that this type of cell therapy is safe and efficient although further research and randomized studies are needed to make this a standard therapy.

Cavernous nerve reconstitution with the use of bone marrow stem cells and erectile function evaluation: an experimental animal study / Avaliação da função erétil após a reconstituição do nervo cavernoso com o uso de células-tronco de medula-óssea: estudo experimental em ratos

Objective: To assess the influence of adult stem cells from bone marrow of rats in the regeneration of cavernous nerve, taking the return of erectile function as a parameter in animals subjected to the apomorphine-induced test of erection. Methods: Forty-eight male Wistar-EPM rats, aged between nine and ten weeks, and weighing approximately 250 g were used. They were randomly divided into four study Groups containing 12 animals each, as follows: Group I: surgical exposure of the cavernous nerves bilaterally without injury; Group II: bilateral surgical injury of the cavernous nerve of approximately 3 mm, without reconstruction; Group III: bilateral surgical injury of the cavernous nerves of approximately 3 mm, and bilateral reconstruction with silicone guiding tubes containing saline solution inside; Group IV: bilateral surgical injury of the cavernous nerves of approximately 3 mm, and bilateral reconstruction with silicone guiding tubes filled with adult stem cells. Four weeks after surgery, the animals were injected with apomorphine for induction of erection. Results: In Group I there was complete erectile response in all animals (100% ? 12 out of 12). On the other hand, none of the animals in Group II presented erection after the use of apomorphine. Five of the twelve animals of Group III (41.7%) and nine of the 12 animals of Group IV (75%) had erections after the stimulus. When we compared the frequency of restoration of erection in the four Groups, Group IV was shown to have a similar performance to Group I (p = 0.217), while Group III animals had a frequency of erections inferior to those in Group I (p = 0.005). Moreover, comparison of results of Groups III and IV versus Group II showed that the frequency of erections was statistically higher in the first two Groups (p = 0.037 and p < 0.001, respectively). Finally, Group IV presented a tendency to a larger number of erections when compared to Group III (75 versus 41.7%) but this difference was not statistically significant (p = 0.098). Conclusion: This study shows that adult stem cells from bone marrow, filling silicone guiding tubes, may promote the regeneration of cavernous nerves and restore erectile function in an animal model.

Objetivo: Avaliar a influência de células-tronco adultas da medula óssea de ratos na regeneração do nervo cavernosos lesado, tomando-se como parâmetro o retorno da função erétil nos animais submetidos ao teste de ereção induzido pela apomorfina. Métodos: Quarenta e oito ratos Wistar-EPM machos, com idades entre nove e dez semanas, pesando aproximadamente 250 g, foram usados e randomicamente subdivididos em quatro grupos de estudo contendo 12 animais cada. Os grupos experimentais foram divididos em: Grupo I: exposição cirúrgica bilateral do nervo cavernoso sem lesão do mesmo. Grupo II: lesão cirúrgica bilateral do nervo cavernoso de aproximadamente 3 mm, sem reconstrução. Grupo III: lesão cirúrgica bilateral dos nervos cavernosos de aproximadamente 3 mm, e reconstrução bilateral com sondas-guia de silicone contendo solução salina em seu interior. Grupo IV: lesão cirúrgica bilateral dos nervos cavernosos de aproximadamente 3 mm, e reconstrução bilateral com sondas-guia de silicone semeadas com células-tronco adultas em seu interior. Quatro semanas após a cirurgia, os animais foram injetados com apomorfina para indução da ereção. Resultados: No grupo I observou-se resposta erétil completa em todos os animais (100% ? 12 em 12). Por outro lado, nenhum dos animais do grupo II apresentou ereções após a administração de apomorfina. Cinco dos doze animais do grupo III (41,7%) apresentaram ereções, enquanto nove dos 12 animais do grupo IV (75%) evidenciaram ereções após o estímulo. Quando foram comparadas as frequências de restauro de ereção nos quatro grupos, demonstrou-se que Grupo IV teve um comportamento semelhante ao Grupo I (p = 0,217), ao passo que os animais do Grupo III apresentaram frequência de ereções inferiores aos do Grupo I (p = 0,005). Por outro lado, a comparação dos resultados entre os Grupos III e IV versus o Grupo II demostrou que a frequência de ereções foi estatisticamente superior nos dois primeiros Grupos (p = 0,037 e p < 0,001, respectivamente). Finalmente, o Grupo IV apresentou tendência a maior número de ereções quando comparado ao Grupo III (75 versus 41,7%), mas essa diferença não foi estatisticamente significante (p = 0,098). Conclusão: O presente estudo demonstra que células-tronco adultas da medula óssea, semeadas em sondas-guia de silicone, favorecem a regeneração dos nervos cavernosos e promovem o restabelecimento da função erétil em um modelo animal.

Diferenciação neuronal in vitro de células-tronco mesenquimais humanas para uso em transplante neural / Neuronal differentiation of human mesenchymal stem cells in vitro for neural transplantation

Introdução. O transplante de células é possibilidade terapêutica promissora para muitas doenças neurológicas. Nos últimos anos, a possibilidade do isolamento de células-tronco dos tecidos adultos, por exemplo da medula-óssea, atrai a atenção da comunidade científica, estratégia que minimiza os problemas éticos relativos ao uso de tecido fetal para implantes visando ao tratamento de doenças neurológicas. Entretanto, a eficiência da transdiferenciação de células-tronco mesenquimais em neurônios, bem como os mecanismos envolvidos nesse processo, permanecem desconhecidos. A obtenção de neurônios maduros ocorreu somente em sistemas de co-cultura, o que induz a questão se a diferenciação representa um potencial das células per si, ou se é possível somente devido à fusão com neurônios maduros. Objetivos. No presente trabalho, pretendeu-se verificar o potencial de as células-tronco mesenquimais tornarem-se neurônios e esclarecer os possíveis mecanismos envolvidos nesse processo. Material e métodos. Células-tronco mesenquimais foram isoladas de 20 doadores voluntários normais e caracterizadas por análise de separação celular ativada por fluorescência. A multipotencialidade foi investigada ao se diferenciar as células em condrócitos e osteócitos. A capacidade de auto-renovação foi confirmada pelo ensaio de incorporação de BrdU. Ulteriormente, as células foram diferenciadas por uma semana em meio contendo AMPc, IBMX, ou combinação de ambos, e os resultados foram comparados com o cultivo em meio básico. Diferentes bloqueadores de Ca2+ ou inibidores de PKA foram usados como tentativa de se impedir a diferenciação, ocorrência que foi mensurada com imunocitoquímica para NF-200 (marcador de neurônios maduros). O registro eletrofisiológico por meio de patch clamp foi usado para se confirmar o fenótipo neuronal. As figuras foram configuradas em microscopia confocal. Para análise estatística foi utilizada ANOVA com teste post-hoc. Resultados. As células isoladas...

Introduction. Cell transplantation has been considered a promising therapeutic approach for many neurological diseases. The possibility of isolation of stem cells from adult tissues, i.e. bone marrow, has attracted the attention of the scientific community in the recent years. This strategy is interesting on avoiding the ethical issues regarding the use of fetal tissue for neural implants. Moreover, the efficiency of the transdifferentiation of mesenchymal stem cells (MSCs) into neurons, and the mechanisms involved in this process remain largely unknown. The obtention of mature neurons was described only in coculture systems, what raised the question if the differentiation is a potential of the cells itself, or if it is possible only due to fusion with mature neurons. Objectives. In the present investigation, we aimed to verify the potential of MSCs to differentiate into neurons, and also to clarify the possible mechanisms involved on it. Material and methods. MSCs were isolated from 20 healthy human subjects and characterized by FACS-analysis. Multipotentiality was addressed by differentiating them into chondrocytes and osteocytes. The self-renewal capacity was confirmed with BrdU-incorporation assay. Afterwards, cells were differentiated for 1 week in a medium containing cAMP, IBMX, or a combination of both, and the results were compared with cells treated in basal-medium condition. Different Ca2+-blockers and PKA-inhibitor peptide were used on an attempt to impair differentiation, which was quantified with NF-200 immunostaining (a marker of mature neurons). Patch-clamp recording was used to confirm neuronal phenotype. Pictures were taken in confocal microscope. For statistical analysis ANOVA with a post-hoc test was used. Results. The isolated cells expressed CD90, 105, 44, and 13, but were negative for CD34 and 45, meaning that they were non-hematopoiethic; 98.74 ± 0.43 % of them incorporated BrdU in 6hs. After isolation, they differentiated into...